La Figure 4-1 présente la procédure d’isolement de Shigella à partir des échantillons de selles. Voir l’Annexe B pour la liste de fournitures nécessaires à l’identification en laboratoire de Shigella.

Pour un isolement optimal de Shigella, deux milieux sont généralement recommandés: un milieu général faiblement sélectif, comme la gélose MacConkey (MAC) et une gélose plus sélective comme la gélose xylose-lysinedésoxycholate (XLD). La gélose désoxycholate-citrate (DCA) et la gélose Hektoen entérique (HE) sont d’autres alternatives à la gélose XLD en tant que milieu de culture de sélectivité moyenne à forte. Ne pas utiliser la gélose SS
car elle inhibe fréquemment la culture de S. dysenteriae type 1.

Si les milieux sélectifs ou différentiels ne sont pas correctement préparés, les réactions des organismes sur ces milieux peuvent être affectées. Par conséquent, il est utile de consulter la section D « Milieux pour l’isolement et l’identification de Shigella » pour discuter de ces milieux, de leur préparation et des souches utilisées pour contrôler la qualité.

Il n’existe pas de techniques d’enrichissement de Shigella meilleures que l’ensemencement direct du milieu pour fournir un taux de récupération optimal.

Les échantillons devront être ensemencés aussi rapidement que possible dès leur arrivée au laboratoire. Les boîtes de Pétri peuvent être inoculées avec une seule goutte de selles liquides ou de suspension fécale. On peut également utiliser un écouvillonnage rectal ou fécal. Si on l’utilise pour inoculer des milieux sélectifs, une surface d’environ 2,5 cm (1 inch) de diamètre est déposée sur les boîtes de Pétri et l’inoculum doit être ensemencé en stries (Figure 4-2). Des milieux très sélectifs tels que XLD demandent un ensemencement en stries croisées plus fines que les milieux peu sélectifs. Quand on ensemence des échantillons primaires sur une boîte pour réaliser un isolement, il est important d’utiliser toute la surface de la gélose afin d’augmenter les chances d’obtenir des colonies bien isolées. Incuber ensuite les boîtes de Pétri pendant 18 à 24 heures à une température comprise entre 35 et 37°C.

Figure 4-1. Procédure d’isolement de Shigella à partir d’un échantillon de selles

2.

Après incubation, noter la quantité et le type de culture (fermentant le lactose ou ne le fermentant pas) sur chaque isolement et ce pour chaque échantillon du patient (un exemple de fiche est présenté sur la Figure 4-3). Les colonies de Shigella sur MAC apparaissent comme des colonies convexes incolores d’un diamètre de 2 à 3 mm environ. Les colonies de S. dysenteriae 1 peuvent être plus petites (Tableau 4-1). Les colonies de Shigella sur la gélose XLD sont des colonies lisses et transparentes, de couleur rose ou rouge avec un diamètre de 1 à 2 mm. Les colonies de S. dysenteriae 1 sont souvent minuscules sur la gélose XLD, contrairement à d’autres espèces de Shigella. Les Figures 4-4 à 4-7 montrent l’apparence typique de Shigella sur géloses XLD et MAC. Il faut prendre les colonies suspectes des boîtes de Pétri MAC et XLD et les inoculer sur un milieu de différenciation tel que la gélose au fer de Kligler (KIA) et le milieu TSI (triple sugar/iron/agar).

Table 4-1. Aspect des colonies de Shigella lors de cultures sur milieux sélectifs

L’identification de Shigella spp. Suppose l’utilisation simultanée des tests biochimiques et sérologiques. Il est généralement conseillé d’utiliser un milieu de différenciation biochimique pour éviter de gaspiller les antisérums. La plupart des laboratoires utilisent les milieux KIA ou TSI pour identifier les souches pouvant être du genre Shigella. Si l’on souhaite faire un test supplémentaire, un milieu de mobilité peut être utilisé pour dépister les souches avant de réaliser une épreuve sérologique. La section D du présent chapitre décrit ces milieux plus en
détails.

Note: la gélose Kligler est une gélose en tube additionnée de fer (iron en anglais) et ayant séché en pente, on parle de Kligler Iron Agar ou KIA.

Pour obtenir de véritables réactions sur KIA ou TSI, il faut y ensemencer une culture pure. Choisir attentivement dans chaque gélose des colonies suspectes et les mettre sur une gélose Kligler (KIA) et un milieu TSI (triple sugar/iron/agar). Placer au moins une colonie bien isolée de chaque type sur chaque gélose. A l’aide d’une anse, toucher légèrement le centre même de la colonie. Ne pas prendre toute la colonie et ne pas la traverser. Ne pas toucher la gélose. Ainsi on évite de récupérer des contaminants qui peuvent se trouver en surface. Si on a du mal à identifier une colonie pure et isolée, on peut la purifier en la repiquant sur une autre gélose afin d’obtenir des colonies pures, isolées à partir desquelles on pourra inoculer les cultures en tubes KIA ou TSI.

KIA et TSI sont inoculés de la manière suivante: ensemencer le fond du tube (culot) en piquant verticalement la gélose puis ensemencer la pente en opérant des stries en zigzag. Après une incubation de 18 à 24 heures à une température comprise entre 35° et 37° C, on observe les géloses en pente en vue de détecter des réactions typiques du genre Shigella. Lors de l’incubation, les bouchons de tous les tubes doivent être dévissés avant d’être mis dans l’incubateur. Cela est particulièrement important pour les milieux KIA et TSI. Si les bouchons sont vissés à fond et s’il existe donc des conditions anaérobies, les réactions caractéristiques de Shigella risquent de ne pas apparaître et cela donnerait un faux résultat. Il est également important que les milieux KIA et TSI soient préparés pour que les tubes aient un culot profond et une longue pente (voir section D).

Généralement, Shigella produit une pente alcaline (rouge) et un culot acide (jaune), pas de gaz et pas de H₂S (Tableau 4-2; Figure 4-8). Quelques souches de S. flexneri sérotype 6 et de très rares souches de S. boydii produisent du gaz dans les milieux KIA ou TSI.

On peut ensemencer un tube de gélose pour l’épreuve de mobilité en réalisant une piqûre sur 1 à 2 cm. Le milieu de mobilité peut être inoculé avec une culture issue de KIA ou TSI indiquant une réaction typique du genre Shigella. On peut également inoculer ce dernier en même temps que les pentes KIA ou TSI en utilisant la même aiguille d’inoculation sans toucher à nouveau la colonie. Le milieu gélosé pour mettre en évidence la mobilité doit être inoculé en premier puis en second on inocule KIA ou TSI en piquant à deux reprises plutôt qu’en une seule fois comme on le fait habituellement. Ne pas choisir une seconde colonie pour inoculer le KIA ou TSI après avoir inoculé le milieu mobilité car on pourrait mettre en évidence un autre organisme.

Observer, après environ 12 heures d’incubation à une température comprise entre 35° et 37° C. La mobilité est indiquée par la présence d’une culture diffuse (ressemblant à une culture brouillée) loin de la ligne d’inoculation (Figure 4-9). Les organismes non mobiles ne se développent qu’au niveau de la ligne d’inoculation. Les milieux pour l’étude de la mobilité ne sont pas toujours faciles à lire par le technicien de laboratoire non expérimenté. Toutes les réactions doivent être comparées avec les souches témoins positives et négatives. Shigella est toujours immobile (Tableau 4-2).

La surface de la gélose pour l’épreuve de mobilité doit être sèche lors de son utilisation. Si de l’humidité s’accumule à l’intérieur du tube, elle peut causer le développement d’un organisme immobile sur le côté de la gélose en créant un développement trouble avec une fausse apparence de mobilité (voir section D).

Le milieu SIM (Sulfide-indole-mobilité) est une combinaison disponible dans le commerce sous forme déshydratée (voir section D). Elle peut être utilisée à la place du milieu de mobilité.

On peut utiliser d’autres tests biochimiques tels le bouillon pour la mise en évidence de l’uréase ou encore la gélose de lysine au fer pour un test supplémentaire des isolements avant les épreuves sérologiques mais il faudra évaluer la valeur de ces tests supplémentaires avant de les employer en routine (Tableau 4-2, Annexe G). La préparation de ces milieux ainsi que les souches proposées pour le contrôle de qualité, sont décrits à la section D.

Bouillon pour mise en évidence de l’uréase

Ce milieu détecte des organismes produisant de l’uréase tels que Klebsiella et Proteus. Inoculer le tube sur toute la surface de la pente. Desserrer les capuchons avant d’incuber pendant une nuit entière à une température entre 35° et 37°C. Les cultures positives pour l’uréase produisent une réaction alcaline dans le tube caractérisée par une couleur rosâtre-rouge (Figure 4-10). Des organismes négatifs pour l’urée ne changent pas la couleur de la culture qui est d’un jaune-rose pale. Shigella est toujours négatif pour l’urée (Tableau 4-2).

Gélose de lysine au fer

La gélose de lysine au fer (LIA) est utile pour le dépistage d’Hafnia spp. et certaines souches de E. coli, Proteus et Providencia. Inoculer la gélose LIA en piquant le fond du culot puis par stries sur la pente. Après une incubation de 18 à 24 heures à une température entre 35 et 37°C, les organismes qui produisent une lysine-décarboxylase sur LIA provoquent une réaction alcaline (couleur violette) dans la totalité du milieu (Figure 4-11). La production d’hydrogène sulfuré noircit le milieu. Les bactéries qui n’ont pas de lysine-décarboxylase présentent généralement une pente alcaline (violette), un culot acide (jaune), pas de gaz et pas de H₂S. Proteus et Providencia spp. présentent souvent une pente rouge due à la désamination de la lysine. La gélose LIA doit être préparée de façon à obtenir la formation d’un culot profond (voir section D).

Shigella spp. ne produit pas de lysine-décarboxylase et présente généralement une pente alcaline (violette) et un culot acide (jaune). Elle ne produit ni gaz ni H₂S (Tableau 4-2).

Figure 4-10. Une couleur rose apparaît dans la réaction positive de l’uréase (tube de gauche)

Figure 4-11. Les organismes positifs pour la lysine décarboxylase produisent une couleur violette sur l’ensemble de la culture LIA (tube de droite). Les organismes négatifs pour la lysine produisent une couleur jaune (acide) dans le culot du tube (tube de gauche).

Il est nécessaire d’effectuer des épreuves sérologiques pour identifier les souches de Shigella. Le genre Shigella se divise en 4 groupes sérologiques dont chacun comprend une espèce avec des antigènes différents. Les sérogroupes A, B, C et D correspondent respectivement à S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii et S. sonnei. Sur les quatre, trois, S. dysenteriae, S. flexneri et S. boydii sont composés d’un certain nombre de sérotypes (voir chapitre 3, Tableau 3-1).

L’identification sérologique est généralement faite par agglutination sur lame avec des sérums polyvalents anti-antigènes O somatiques, suivie, dans certains cas, de l’agglutination avec un antisérum monovalent pour identifier un sérotype spécifique. Un antisérum monovalent anti S. dysenteriae type 1 est nécessaire pour identifier ce sérotype qui est la cause la plus fréquente de dysenterie épidémique grave. Quand une colonie provenant d’une gélose a été identifiée comme Shigella, aucune autre colonie issue du même spécimen n’a besoin d’être testée.

Les techniciens de laboratoire doivent se rappeler que certains antisérums commerciaux pour Shigella ont une appellation ou un conditionnement différents. Par exemple, Shigella polyvalent A qui comprend des antisérums des sérotypes 1 à 7, est également appelé polyvalent A1. Autre source de confusion: l’antisérum monovalent peut avoir une étiquette pouvant faire croire qu’il s’agit d’un antisérum polyvalent. Par exemple, l’antisérum monovalent à S. dysenteriae 1 peut être appelé Shigella A1 au lieu de S. dysenteriae type 1. Quand il utilise des antisérums achetés depuis peu, le technicien de laboratoire doit lire attentivement la notice de la boîte ou demander des renseignements supplémentaires au fabricant si les étiquettes ne sont pas claires.

Comme S. dysenteriae 1, suivi de S. flexneri et S. sonnei, est l’agent le plus commun de la dysenterie épidémique, les souches qui réagissent lors des épreuves biochimiques doivent être étudiées en priorité avec l’antisérum monovalent A1, puis avec l’antisérum polyvalent B et finalement avec l’antisérum polyvalent D.

Les tests d’agglutination peuvent être réalisés dans une boîte de Pétri ou sur une lame propre. On utilise une anse, une aiguille d’inoculation, un applicateur ou encore un cure-dent stérile pour retirer une partie de la culture de la surface d’un KIA, d’un TSI, de la gélose d’infusion de coeur (HIA) ou d’une autre gélose non sélective. La sérologie ne peut pas être effectuée sur une culture provenant d’un milieu sélectif tel que MacConkey ou XLD car cela peut donner des résultats faussement négatifs. Réaliser deux suspensions en émulsionnant la culture dans deux petites gouttes de solution salée physiologique et bien mélanger. Ajouter une petite goutte d’antisérum à l’une des suspensions. En général, on mélange des volumes plus ou moins égaux d’antisérum et de suspension de la culture mais le volume de suspension peut être le double du volume de l’antisérum. Pour économiser l’antisérum, on peut abaisser la quantité de ces volumes à 10 microlitres lors de leur utilisation. On peut se servir d’une anse d’inoculation calibrée pour dispenser de très petites quantités d’antisérum si on dispose pas de micropipettes automatiques (Figure 4-12). Bien mélanger la suspension et l’antisérum et incliner la lame alternativement d’un côté et de l’autre pour observer l’agglutination. Si la réaction est positive, des agglutinats vont apparaître dans un laps de temps compris entre 30 secondes et une minute (Figure 4-13). Examiner attentivement la suspension saline pour vérifier qu’elle ne contient pas de grumeaux dus à un phénomène d’autoagglutination. Si des grumeaux se forment, la culture est dite rugueuse et il est impossible de la sérotyper.

Les cultures qui réagissent sérologiquement et qui n’ont pas de résultats contradictoires aux tests biochimiques sont notifiées comme positives pour Shigella. Des souches négatives lors de l’épreuve sérologique, et qui sont identifiées par voie biochimique comme étant du genre Shigella peuvent être envoyés à un laboratoire de référence.

Tous les lots d’antisérums doivent faire l’objet d’un contrôle de qualité avant l’utilisation. Le chapitre 11 traite du contrôle de qualité des antisérums.

Cette section comprend la description de tous les milieux mentionnés dans le présent chapitre ainsi que leurs caractéristiques, préparation et souches adéquates en vue du contrôle de qualité de leur préparation. Le numéro du lot du milieu déshydraté commercialisé ou chaque numéro de lot des ingrédients individuels utilisés pour la fabrication devront faire l’objet d’un contrôle de qualité avant utilisation. Voir le chapitre 11 pour une description des méthodes adéquates de contrôle de qualité.

La gélose DCA est un milieu sélectif servant à isoler des pathogènes intestinaux notamment Shigella et Salmonella. Les souches fermentant le lactose produisent des colonies roses entourées d’une zone de précipitation de bile. Les organismes des souches ne le fermentant pas sont incolores.

Plusieurs formulations de gélose DCA, éventuellement variables concernant leur sélectivité, sont disponibles auprès de divers fabricants.

Préparation et contrôle de qualité

Préparer selon les instructions du fabricant. (Note: On peut également les préparer à partir d’ingrédients individuels mais cela donnera une différence plus importante entre les lots par rapport aux préparations commerciales déshydratées.) Le milieu DCA est très sensible à la chaleur et il faut éviter de le porter à ébullition. Ne pas autoclaver. Les boîtes de Pétri peuvent être conservées à 4°C pendant une semaine au maximum. Pour le contrôle de qualité de la DCA, les organismes suivants devront être adaptés à la confirmation des caractéristiques de croissance sélective et inhibitrice. E. coli peut être plus ou moins inhibé mais produira des colonies roses entourées d’une zone de bile précipitée. S. flexneri et S. dysenteriae 1 produiront un assez bon développement de colonies incolores.

La gélose HE est un milieu sélectif différentiel utile pour l’isolement de Salmonella et Shigella. C’est un système d’indicateur H₂S pour repérer les Salmonella productrices d’H₂S et se présentant sous la forme de colonies bleues et vertes avec un centre noir. Les colonies Shigella sont vertes alors que celles qui fermentent le lactose comme E. coli sont de couleur rose ou orange avec une zone de précipitation de la bile.

Préparation et contrôle de qualité

Préparer selon les instructions du fabricant. (Note: Plusieurs marques commerciales de milieu HE sont disponibles. Ce milieu peut être également préparé à partir d’ingrédients séparés mais les résultats risquent d’être bien différents de ceux obtenus à partir de la formule déshydratée commerciale.) Chauffer en faisant bouillir pour dissoudre mais éviter de surchauffer. Ne pas autoclaver. Quand la préparation est assez froide pour être versée, mettre dans les tubes. Les tubes peuvent être conservés à 4°C pendant une semaine maximum.

Pour le contrôle de qualité du milieu HE, les micro-organismes suivants sont adaptés à la confirmation des caractéristiques de croissance sélective ou inhibitrice: E. coli devra produire des colonies roses ou oranges entourées d’une précipitation de bile; S. flexneri devra produire un assez bon développement de colonies vertes mais les colonies de S. dysenteriae 1 seront probablement plus petites.

KIA et TSI sont des milieux de différenciation contenant des hydrates de carbones utilisés pour isoler des pathogènes intestinaux, dont Shigella. Ces milieux font la distinction entre les organismes qui fermentent le lactose et ceux qui ne le fermentent pas et possèdent un indicateur de sulfure d’hydrogène. Les organismes produisant H₂S noirciront le milieu KIA et TSI.

KIA contient du glucose et du lactose. Les organismes fermentant le glucose produiront un culot acide (jaune); certains produisent également du gaz. Les organismes fermentant le lactose auront une pente acide (jaune) et les organismes qui ne le fermentent pas auront une pente alcaline (rouge).

TSI contient du saccharose en plus des ingrédients du KIA. La fermentation du glucose par les micro-organismes se traduira par l’acidification du culot qui sera jaune avec une éventuelle production de gaz. Avec les micro-organismes fermentant le lactose, la pente sera acidifiée (jaune). En l’absence de fermentation du lactose, cette pente restera alcaline (rouge).

Préparation et contrôle de qualité

Préparer selon les instructions du fabricant. (Note: Il existe plusieurs formules déshydratées de KIA et de TSI disponibles dans le commerce. Ces milieux peuvent être également préparés à partir d’ingrédients séparés mais cela risque de provoquer des variations d’un lot à l’autre.) Placer une quantité du milieu dans des récipients adaptés afin que le volume soit suffisant pour donner un culot profond et une longue pente. Mettre 6,5 ml de milieu dans des tubes de 16 x 125 mm avec des bouchons hermétiques (les bouchons ne doivent pas être serrés à fond) et stériliser à l’autoclave puis laisser les tubes se solidifier de façon à obtenir un culot de 3,5 cm et une pente de 2,5 cm. Visser les bouchons à fond et conserver à 4°C pendant 6 mois au maximum.

Pour le contrôle de la qualité de KIA ou de TSI, les organismes suivants sont adaptés pour confirmer les caractéristiques de réponses biochimique: E. coli devra donner une pente et un culot acides avec production de gaz mais pas de H₂S; S. flexneri devra donner une pente alcaline et un culot acide sans production de gaz ou de H₂S (Figure 4-8); une souche de Salmonella produisant de l’H₂S peut être utilisée pour contrôler cette réaction.

Les organismes qui produisent une décarboxylation de la lysine dans LIA donnent une réaction alcaline (couleur violette) sur le culot et la pente du milieu (Figure 4-11). La production de H₂S est indiquée par un noircissement du milieu. Les organismes ne décarboxylant pas la lysine, tels que Shigella, produisent généralement une pente alcaline (violette) et un culot acide (jaune), pas de gaz et pas d’H₂S (Tableau 4-2). Proteus et Providencia spp. produisent souvent une pente rouge suite à la désamination de la lysine. LIA doit être préparé afin que le volume du milieu contenu dans le tube soit suffisant pour donner un culot profond. Il est important que les tubes de LIA aient un culot profond car la réaction de décarboxylation ne se produit que dans des conditions d’anaérobie.

Préparation et contrôle de qualité

Préparer le milieu selon les instructions du fabricant qui figurent sur la bouteille. (Note: Il existe plusieurs sociétés qui vendent du LIA déshydraté. LIA peut également être préparé à partir d’ingrédients séparés mais il peut y avoir des différences d’un lot à l’autre.) Mettre 6,5 ml de milieu dans des tubes de 16 x 125 mm avec des bouchons pouvant être vissés à fond (laisser les bouchons desserrés). Stériliser à l’autoclave. Laisser les tubes se solidifier afin d’obtenir un culot de 3,5 cm et une pente de 2,5 cm. Une fois le milieu refroidi et solidifié, serrer les bouchons à fond et conserver à 4°C pendant 6 mois maximum.

Pour le contrôle de qualité de LIA, on peut utiliser les organismes suivants: S. flexneri devra donner une pente alcaline et un culot acide sans production de H₂S. On peut utiliser une souche de Salmonella produisant de l’H₂S pour contrôler la réaction H₂S et visualiser la présence d’une probable lysinedécarboxylase donnant une réaction alcaline dans le culot du tube.

La gélose de MacConkey (MAC) est un milieu recommandé pour l’isolement et la différenciation entre les germes intestinaux gram négatifs qui ne fermentent pas le lactose et ceux qui le fermentent. Les colonies de Shigella dans la gélose de MacConkey apparaissent convexes et incolores avec un diamètre de 2 à 3 mm. Les colonies de S. dysenteriae type 1 peuvent être plus petites. Il existe plusieurs marques disponibles dans le commerce de gélose de MacConkey. La plupart des fabricants préparent des gélose de MacConkey dont la sélectivité varie, ce qui se répercute sur l’isolement de Shigella. Par exemple, certaines formulations de MacConkey ne contiennent ni cristal violet, un agent sélectif, ces milieux ne devraient pas être utilisés pour l’isolement de Shigella. Oxoid MacConkey Agar No 3, Difco Bacto MacConkey et BBL MacConkey Agar conviennent parfaitement.

Préparation et contrôle de qualité

Préparer selon les instructions du fabricant. (La gélose MAC peut également être préparée à partir d’ingrédients séparés mais cela donne des résultats bien différents de ceux que l’on obtient avec une formulation déshydratée commerciale.) Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Refroidir à 50°C et verser dans des boîtes de Pétri. Laisser les couvercles légèrement ouverts pendant 20 minutes pour que la surface de la gélose sèche. Fermer le couvercle et conserver à 4°C pendant un mois maximum. Si on veut conserver les boîtes pendant plus de quelques jours, mettre les tubes dans des sachets en plastique hermétiquement fermés afin que le milieu ne se dessèche pas. Pour le contrôle de qualité de MAC, les organismes suivants sont adaptés pour confirmer les caractéristiques de croissance sélective et inhibitrice: E. coli devra produire des colonies roses à rouges avec une culture allant de bonne à excellente. S. flexneri devra produire des colonies incolores avec un développement relativement bon mais les colonies de S.dysenteriae 1 peuvent être plus petites.

Comme Shigella spp. est toujours immobile, le milieu de mise en évidence de la mobilité représente un test de dépistage utile. La mobilité est indiquée par la présence d’une culture diffuse (comme si elle se brouillait) loin de la ligne d’inoculation (Figure 4-9). Les organismes immobiles ne se développent pas en dehors de la ligne d’inoculation.

Préparation et contrôle de qualité

Suivre les instructions du fabricant pour la réhydratation du milieu en poudre. (Note: Il existe plusieurs formulations de milieux déshydratées disponibles dans le commerce pour mettre en évidence la mobilité. Ce milieu peut également être préparé à partir de produits disponibles au laboratoire.) Chauffer en faisant bouillir pour être sûr que le milieu est entièrement dissous. Mettre environ 4 à 5 ml de milieu par tube de dimension 13 x 100 mm avec un bouchon laissé desserré mais pouvant être fermé à fond, et stériliser à 121°C pendant 15 minutes. Laisser la culture se solidifier. Après solidification et refroidissement de la gélose, laisser le bouchon desserré jusqu’à ce que la surface du milieu soit sèche. Visser le bouchon à fond et conserver à 4°C pendant 6 mois maximum.

Pour le contrôle de qualité du milieu de mise en évidence de la mobilité, on peut utiliser les organismes suivants: E. coli qui est mobile et Shigella spp. qui est immobile. La surface du milieu doit être sèche lors de son utilisation. Si de l’humidité s’accumule à l’intérieur du tube, il faut la retirer soigneusement avant d’ensemencer le tube. L’humidité peut causer le développement d’un organisme immobile sur le côté de la gélose créant un développement trouble avec une fausse apparence de mobilité.

Le milieu SIM combine trois tests en un seul tube – production de sulfure d’hydrogène, production d’indole et visualisation de la mobilité. La réaction d’indole n’est pas nécessaire pour dépister des souches suspectes du genre Shigella car les réactions des souches sont variables. Il est ensemencé comme le milieu de mise en évidence de la mobilité en utilisant une aiguille pour piquer sur une profondeur d’environ 1 à 2 cm puis il est incubé à 35° C pendant 18 heures. La réaction de mobilité est lue de la même manière que pour le milieu de mise en évidence de la mobilité. La production de sulfure d’hydrogène est indiquée par le noircissement du milieu, comme pour KIA ou TSI. La production d’indole peut être testée par la méthode du papier filtre ou en ajoutant dans le tube quelques gouttes de réactif de Kovac.

Préparation et contrôle de qualité

Suivre les instructions du fabricant pour la réhydratation du milieu. Chauffer jusqu’à ébullition afin que le milieu soit entièrement dissous. Mettre dans des tubes et stériliser en passant à l’autoclave pendant 15 minutes à 121° C.

Pour le contrôle de qualité du milieu SIM, on peut utiliser les organismes suivants: E. coli est positif pour l’indole, H₂S négatif et positif pour la mobilité. Une souche de Salmonella produisant de l’H₂S peut être utilisée pour contrôler la réaction. Elle sera probablement mobile et négative pour l’indole. Shigella spp. est négatif pour la mobilité, H₂S-négatif mais variable concernant la réaction pour l’indole.

Les cultures positives à l’uréase produisent une réaction alcaline (couleur rouge) dans le milieu (Figure 4-10). Les organismes négatifs à l’uréase ne changent pas la couleur du milieu qui est d’un jaune-rose pale. Shigella est toujours négatif à l’uréase (Tableau 4-2).

Préparation et contrôle de qualité

Suivre les instructions du fabricant pour la préparation. (Note: Il existe dans le commerce plusieurs marques de milieu pour le test de l’uréase dont certaines demandent la préparation d’un bouillon stérile qui est ajouté à la gélose autoclavée. Certains fabricants ont des concentrés d’urée stérile prêts à l’emploi.)

Préparer la base de gélose à l’urée comme indiqué sur la bouteille. La stériliser à 121°C pendant 15 minutes. Laisser refroidir à une température de 50 à 55°C, et ajouter ensuite le concentré d’urée en suivant les indications du fabricant.Avant d’ajouter l’urée à la gélose, vérifier que la gélose est froide car l’urée est thermolabile. Mélanger et verser dans des tubes stériles. Incliner le milieu pour qu’un culot profond se forme.

Pour le contrôle de qualité du milieu pour la recherche de l’uréase, on peut utiliser les organismes suivants: Proteus spp. est positif à l’uréase. E. coli est négatif à l’uréase.

Ce milieu différentiel sélectif convient bien à l’isolement direct de Shigella et de Salmonella dans les échantillons de selles. La différenciation de ces deux espèces par rapport à des bactéries non pathogènes se fait à l’aide de la fermentation du xylose et du lactose, la décarboxylation de la lysine et la production de sulfure d’hydrogène.

Les colonies Shigella sur la gélose XLD sont des colonies transparentes et lisses d’une couleur rose ou rouge avec un diamètre de 1 à 2 mm (Figure 4-5). Les colonies de Shigella dysenteriae type 1 dans la gélose XLD sont souvent très petites, contrairement aux autres espèces de Shigella (Figure 4-4). Les coliformes vont apparaître en jaune (Figure 4-6). Les colonies de Salmonella sont généralement rouges avec un centre noir mais elles peuvent être jaunes avec un centre noir.

Préparation et contrôle de qualité

Préparer selon les instructions du fabricant. (Note: Il existe plusieurs marques disponibles dans le commerce de la gélose XLD. Ce milieu peut également être préparé avec des ingrédients séparés mais aura des résultats bien différents de ceux obtenus avec un milieu déshydraté commercial.) Bien mélanger. Chauffer à feu fort jusqu’à ébullition du milieu. Ne pas surchauffer (surchauffer lors de l’ébullition, ou alors laisser le milieu refroidir trop longtemps provoque sa précipitation). Faire refroidir la solution sous l’eau froide pour qu’elle puisse être coulée. Éviter également de laisser refroidir trop longtemps le milieu. Couler dans des boîtes de Pétri, en laissant le couvercle légèrement ouvert pour que la surface de la gélose puisse sécher. Les boîtes de Pétri sont conservées à 4°C pendant une semaine maximum.

Pour le contrôle de qualité, les organismes suivants sont appropriés pour confirmer les caractéristiques de croissance sélective ou inhibitrices. S. flexneri doit produire une culture moyenne à bonne de colonies lisses (Colonies S) transparentes roses ou rouges avec un diamètre de 1 à 2 mm. S. dysenteriae 1 doit produire des petites colonies transparentes roses ou rouges. E. coli doit produire une culture faible à moyenne de colonies jaunes.

Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strockbine NA. Escherichia, Shigella and Salmonella. Dans: Murray PR, Pfaller MA, Tenover FC, Baron EJ, Yolken RH, ed. Manual of clinical microbiology, 7e ed. Washington, DC: ASM Press; 459- 474.

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Organisation Mondiale de la Santé. Guidelines for the control of epidemics due to Shigella dysenteriae 1. Genève: OMS; 1995. Publication no. WHO/CDR/ 95.4.