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Citation | Submit Manuscript 产志贺毒素大肠杆菌的毒性基因表达：抗生素的作用和细菌SOS反应 Patrick.T.Kimmitt, Colin.R.Harwood, Michael.R.Barer. 摘要 产志贺毒素大肠杆菌的毒性系统可以通过能够编码毒性基因的整合噬菌体来诱导噬菌体的产生是同细菌SOS反应（SOS反应是一种对DNA破坏的独特反应）的诱导相联系的。SOS所介导的抗微生物药物，尤其是喹诺酮类、甲氧苄氨嘧啶和呋喃唑酮，在研究它们对带有Stx2::lac染色体基础的翻译改变的STEC报告菌株作用效果时，显示能够诱导毒性基因的表达。在高于抑制细菌复制的抗微生物水平时，这些药物是志贺2型基因（Stx2）翻译的强诱导物。因此，在处理潜在或确诊的STEC感染的病人时应避免使用这些药物。其它药物（20种）和培养条件对Stx2的翻译产生了重要的但不关键的作用；我们观察了阳性和阴性的影响。由SOS中介的对毒性系统的诱导也提供了能使STEC感染恶化和Stx基因释放增加的机制。这些特征和在临床和畜牧业上使用的抗生素可以解释近期的STEC病的急性症状。 大肠杆菌O157：H7感染、出血性结肠炎和HUS症的联系，在二十世纪八十年代早期就已确立（1，2）。产志贺毒素大肠杆菌（STEC）菌株自发现以来就被认为是腹泻与HUS暴发以及零星发生的病因，产生了成千上万的病例并且有不少人死亡（3）。志贺毒素是STEC病发病机制的关键毒力因子（3）。相关志贺毒素（Stx）涉及到两个家族的有关毒素即Stx/Stx1，它包括由痢疾杆菌产生的古典志贺毒素和Stx2（4）。由STEC菌株携带的Stx基因（有一种即Stx2e除外），由噬菌体基因组整合到细菌染色体而编码。产Stx2的STEC菌株同HUS的联系比仅产Stx1的菌株同HUS的联系更加紧密（5，6）。 因为抗菌物在严重的STEC病的发病机理中有一定的作用，因此化学疗法用于治疗STEC感染仍有争议（7，8）。Stx基因（位于λ噬菌体基因组的突出部位并整合到宿主菌的染色体中）的位置是十分重要的暗示，因为SOS反应的诱导（一个较广泛的调整性遗传机制），诱导了高水平的以前沉寂的噬菌体基因高水平的表达（9）。Stx基因是同噬菌体基因协同表达的（10，11），某些喹诺酮类（已知是SOS的强诱导物）的诱导是毒性增强使噬菌体的产量在2-4小时内增加2-3倍。对SOS反应、Stx1前期诱导以及Stx表达联系的潜在重要性的认识近来已经通过序列以及病原体分析得到进一步加强（11，14，15）。 我们已经构建了一个以临床分离的遗传学修饰物，在那里，编码的两种毒素（Stx2AB）的基因已部分被报导的LacZ基因所取代。该基因的产物，β-半乳糖苷酶，是很容易被分析和检测的；它的表达反映了对Stx2基因的翻译行为。能够用简单的琼脂平皿分析所观察到并能用生化分析来鉴定。我们已延续了我们早期对喹诺酮作用于报导菌株表达效果的观察，这些观察包括了广泛的抗菌物的作用以及对不同环境条件效果的调整。我们的结果显示，几种抗菌物能增加毒物产生的数量，同时，SOS诱导物在STEC感染的流行病学中起一个重要的角色。
RV31，一株从出血性腹泻病人体内分离的大肠杆菌O157:H7,被用于构建相应的菌株。PK522(Stx2A::LacZ),它含有大肠杆菌Lac基因翻译性融合到位于染色体上的Stx2启动子片段后的拷贝物。报导菌株的构建将在后面来描述，它包括一系列自毁质粒向量的穿梭交换。第一步，除去所有的固有Lac操纵子和相临的LacI 基因以构建Lac-菌株。接着，用无启动子的大肠杆菌LacZ基因去替换Stx2A基因的大部分编码序列。结果在翻译融合里，LacZ报导基因的翻译由Stx2基因所控制。最终的构建结构用诊断性多聚酶链反应、Southern斑点杂交以及通过LacZ插入点的核苷酸序列测定等方法来证实。 细菌在抗生素中生长用BioscreenC系统以及与之相连Biolink软件（Labsystem, Basing stroke, UK）来监测。这些程序允许同时进行200次测试并能记录光密度的变化。含Stx2::LacZ的报导菌株PK522在37℃、3号抗生素培养基（Oxoid, Basing stroke, Hampshire, UK）的培养条件下过夜。2ml能去除的过夜培养物加入到100ml加温的的介质中，在37℃下振摇孵化到在600nm的光密度大约未0.4。接着这些培养物被裂解，测试的抗生素加入到这些从常备的溶液中得来的 aliquat。这些培养物的按等份(200μl,4倍复制)注入到honeycomb板孔里。Biolink软件用以去指示BioscreenC系统监控波长、孵化温度、试验长短以及培养物振摇的频率等。培养物37℃于BioscreenC系统里孵育时要不停地振摇。OD600的值每隔15min记录一次。所选抗生素的MIC值通过用前面描述的接种模式和常用的琼脂稀释法以BioscreenC系统来确定。 β-半乳糖苷酶活性的检测 用琼脂平板分析去检测在所用抗生素条件下产生β-半乳糖苷酶活性的报道菌株PK552(Stx2A::LacZ)。分析使用包括20μg/ml色原乳糖analogX-gal(5-溴-4-氯-3-碘-β-D-galactopytanoside; Sigma, Poole, Dorset, UK)的LB琼脂平板来进行。涂布PK552菌株，混入100μl过夜培养物并加入3ml熔化的LB高层琼脂，冷却到48℃而制成，然后将混合物倾入到LB平皿的表面。平皿同放在表面的抗生素片在特定的条件下一起孵育。β-半乳糖苷酶的表达用X-gal酶裂来分析，结果应显蓝色，深浅与产生的酶的量有关。 微需氧菌生长条件（5%O2,10%CO2,85%N2）在37℃下用真空孵化器来产生（Don Whithey Scientific, Shipley, Yorkshive, UK）.在42℃条件下，微需氧菌生长条件和厌氧菌条件用气罐来产生。 抗生素片（Oxoid/unipath）如下：氧氟沙星（5μg），萘啶酸（30μg），西诺沙星（100μg），依诺沙星（5μg），flinequine(30μg)，环丙沙星（1μg），派氟沙星(5μg)，诺氟沙星（10μg）阿莫西林/克拉维酸（20/10μg），依米配能（10μg），阿斯非诺龙（30μg），头孢他定（30μg），头孢唑污（30μg），头孢呋新（30μg），氧派嗪青霉素/泰唑派酮（10/75μg），氨苄青霉素（10μg），cephlexin(30μg),chloramplenicol(30μg)，多四环素(30μg)，红酶素（15μg），TMP(5μg)， sulphamethoxazole(25μg),呋喃唑酮（50μg），阿莫西林（25μg）,novobiocin(30μg),利福平（25μg），庆大霉素（10μg），膦酶素（200μg），多粘菌素B（300IU），甲硝唑（50μg）。 BioscreenC系统也在PK552菌株的ONPG试验中用于测量总β-半乳糖苷酶活性（16）。从honeycomb平皿中取培养物的aliquats(20μl,4份)加入到另一平皿中，180μl含有2mg/ml溶酶体、0.01%SDS、100μg/ml chloramplenicol的缓冲夜（60mM Na2HPO4.7H2O,40mM NaH2PO4.H2O, 10mM KCL,1mM MgSO4和50mMβ-Mercaptoethanol）加入到细胞中。平皿在37℃孵育30min以lyse细胞，然后放于冰上直至使用。BioscreenC系统先预热到28℃，加40μl 4mg/ml的ONPG溶液（用缓冲液配制）于每一孔中，平皿在BioscreenC系统中于28℃孵育4h，每隔10min记录三次420和540nm的OD值。调整样品体积后，由Miller公式即OD420/t的线性部分来确定β-半乳糖苷酶活性。在所有测定中，平行样的系数变化应小于10%。 结果 所有的喹诺酮诱导了报道的表达，但仅有少部分其它抑菌物有这样的效果（图1）。诱导有三种普通模式：生长确定的抑制圈（喹诺酮类），生长与不生长交接处的特定圈（呋喃唑酮），扩散抑菌圈（TMP）。此外，培养条件产生了诱导或抑制的背景。微需氧菌在30℃的培养条件与背景诱导的联系较小，厌氧菌在42℃的培养条件有一种由蓝色圈的深浅决定的抑制效果。但是，一些由喹诺酮介导的诱导甚至是在最抑制的条件（42℃）下还是可以检测的。一般而言，呋喃唑酮和TMP的诱导提高或降低都很相似，虽然在42℃消除各种诱导，厌氧菌的生长条件并不能降低TMP/SMZ的诱导。 作为一个组，仅仅有那些抑制原核生物翻译的抗菌物在测试的条件下不能去诱导报导的表达（表），如呋喃唑酮，虽然作用不是很强，几种β-lactam类抗菌物却能在生长与不生长的界面上诱导表达。依米配能不但能诱导表达而且在亚生长水平下，而且在相邻的monobactam, aztreonam的作用下也能抑制诱导。我们接着观察到由β-lactam介导的诱导限制这种抑制效果（如依米配能对喹诺酮类、TMP、呋喃唑酮）。我们也观察了阿莫西林克拉维协同作用联结中克拉维酸作用于阿莫西林是明显的抑制效果，同时要求检测有monobiocin，多粘菌素B、利福平诱导的潜在条件。 我们检测了暴露在液体培养基中的抗生素诱导的培养物里的β-半乳糖苷酶定量分析的一些特性（图2，3）。诱导同MIC的关系与平皿分析是一致的。头孢唑污和呋喃唑酮表现出了亚MIC水平的诱导，但是氧氟沙星和TMP的最高诱导水平在高于MIC暴露水平出现；可以清楚的看到后两种抗菌物是更强的诱导物（图2，3）。我们也检测膦酶素（0.03-80mg/l）的效果，没有检测出诱导作用。 用时间过程试验（图3）证实了相关的诱导力度（表2），同时显示呋喃唑酮介导了在8小时水平呋喃唑酮酶活性完成的诱导，其中，24h水平比8h水平高，但4和12h的水平比24h要高。相比较而言，TMP和氧氟沙星的诱导在6-8h时迅速增长，紧接着，诱导继续增长，但速度变慢，直到12h作最后测定时，由这两种抗菌物诱导的额外的表达持续到24h（图2），但头孢唑污诱导的表达仅仅在12-24h内发生。 讨论 这些报道基因的表达模式说明几种抗菌物能增加STEC菌株合成 Stx2基因的量。β-半乳糖苷酶在报导菌株中的表达水平与亲代野生型菌株产生的生物活性毒素密切相关（12）。与de novo基因表达有关的联系与我们早期的工作有些区别，在那些工作里，不能决定增加的毒性水平是由细胞溶解而释放毒还是由于增加合成所造成的（17-20）。我们所观察的诱导显示，某些抗菌物和环境条件可能使受感染的人们增加毒素的量，同时，目前有限的临床资料也提供合理的基础去避免用某些抗菌物去治疗可能有STEC感染的病人。 这里测试过的几种抗菌物喹诺酮类（21）、TMP（22）、呋喃唑酮和咪唑尼达（23）已被认识到能诱导细菌的SOS反应，当破坏细菌DNA以及激活多重功能性 RecA蛋白时该反应将开始启动。接着激活的 RecA使两种关键的抑制子蛋白LexA和CI降解。结果由LexA调节的基因抑制将导致DNA系统和细胞分裂暂时停止，以及有错误倾向的DNA修复的激活。在携带有整合的λ-噬菌体的菌株中，紧随着噬菌体颗粒和宿主菌细胞溶解的发生，CI噬菌体抑制/激活蛋白的分裂，也将导致先前沉寂的噬菌体编码基因（这里包括Stx2A和Stx2B）的诱导。 大部分强SOS诱导物，如喹诺酮和TMP，在琼脂和液体培养分析中产生最突出的结果。咪唑尼酮在测试的条件下不能诱导报导的表达；但是，这些抗菌物将不被正常地使用去影响E.coli。另一种强SOS诱导物，丝裂酶素，已知在Vitro中增加毒性水平（24，25），用报导菌株进行琼脂和肉汤诱导测试，结果均是阳性的。在Vivo中SOS反应对发病机制潜在的重要性在近来的一个基因中有突变的STEC菌株的研究中被强调，这些菌株在鼠LD50的测试中被认为有抗病毒作用。 如果这些被暗示的抗菌药在某些方面是同STEC病的发生和加重相联系的话，那么抗生素诱导Stx表达的重要性将被加强。这些可利用的研究结果与相关的抗生素的影响有冲突。老年组的研究、抗生素治疗的时间和抗生素使用的范围是分析变的复杂，但是，喹诺酮、TMP/SMZ(26,27)的使用被暗示是HUS的一个危险因素。在近来的临床研究中，用cephalosporins或TMP/SMZ治疗的儿童，相应的HUS病危险性增加了13.4和17.7倍的（28）。我们的观察建议，感染病人暴露于每一种抗生素毒素所产生毒物的交叉效果依靠感染阶段、同期抗生素作用机体的数量、机体的瞬时环境条件、时间浓度水平以及药物的杀菌效果。这些复杂的相互作用因子在不同的条件下能导致有利的、中性的或不利的临床抗生素SOS诱导（例如：如果感染物的数量对产生大量的毒素是不足的，那么它们将被初始剂量所杀灭）。 此外，其它潜在的SOS-诱导物的暴露（cf.9,23）会使得抗生素的使用和STEC疾病严重性的关系更加复杂化。在丝裂酶素C的使用和HUS之间的突出的联系在一个“癌相关”HUS研究中被发现（29）。 Grif和同时们报导了亚MIC的13种抗生素作用于三种释放生物活性毒素的过夜培养的位于上清液中的STEC菌株的效果（20），这些作者观察了在这些反应中大量的相互作用菌株的不同，同时当暴露于几种以前没有SOS-诱导活性的抗菌物以后毒素的产生水平也会提高。Grif等没有区分最强的诱导效果的毒素产量释放增加与增加的毒素产量，我们所观察的最强的诱导效果在超抑制暴露水平。但是，我们没能归纳出相互作用菌株对SOS感受性和卷入的其它诱导机制的可能性的不同。我们对几种有β-lactam物介导的诱导和依咪配能的抑制效果的观察是明显相关的。依咪配能对表达的抑制支持先前对毒素释放的观察（30）。用依咪配能和其它已知的有SOS诱导的抗生素的平行平皿释放分析显示β-lactam物诱导限制的结果。这些发现同不同时间的头孢唑污的诱导过程相联系。支持了一个存在区别于SOS反应的诱导途径的观点。虽然putative alternate诱导途径的特性仍然不清晰。有关β-lactam介导的诱导证据从反面证实了在治疗STEC感染病人时所用的抗菌药的用途。 虽然暴露于志贺毒素的STEC感染病人的增加看上去没有多大用途，但SOS介导的诱导特别危险，因为它有潜在的快速效果。我们报导的动力学（图3）在某些方面比先前我们观察的再振动的锥形长试管中孵育的（12）要慢一些。同SOS诱导相联系的毒素水平的快速生成有利于毒素进入血流，紧接着作用于肾和其它器官。SOS-介导的诱导也能导致毒性编码的噬菌体的传播。 Matsushire等观察到在与诺氟沙星作用时毒素与噬菌体数量是平行增加的（13），我们对氧氟沙星和TMP作了相似的观察。此外，紧接的研究清楚的显示Stx2与噬菌体基因的表达是一样的有规则（11，14）。出血性结肠炎和HUS属于STEC是在TMP和4-喹诺酮被人们了解并用于临床实践以及近来在广泛使用荧光喹诺酮后STEC疾病大量增加后被认识的。 荧光喹诺酮和TMP被建议用于预防和治疗旅行者的腹泻（31），前者被常用于治疗严重的细菌性肠感染。我的发现显示如果STEC 感染是一种可能性那么这种方法可能是不恰当的。此外，报告显示某种抗菌药物可能改善或减轻症状或STEC 感染的生命受威胁的复杂性频率，STEC 感染提供了一个动因去发现合理的基础以供选择（8，27）。我们的结果建议，具有SOS诱导活性的抗菌物、抗生素或其他药物应该避免（表）。 最后，我们总结出，SOS介导的志贺毒素的诱导可能导致STEC疾病的急性流行模式。许多其它细菌的独立决定物被溶原性噬菌体基因组编码（32），增长的这些现象可能有超越对STEC病的理解，而是公共卫生和临床方面的知识。 References
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